Студопедия — Простые и сложные методы окраски

6. Методы окраски микробов и их отдельных структур.

Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор — анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители — генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

7. Морфология и химический состав бактерий. Протопласты. L – формы бактерий.

Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и яд­ра, называемого нуклеоидом. Имеются дополни­тельные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях спо­собны образовывать споры.

Клеточная стенка. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90 % массы клеточ­ной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos — стенка).

В состав клеточной стенки грамотрицательных бакте­рий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутрен­ней мембраной, которую называют цитоплазматической. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид.

Читайте также:  Купить La Roche-Posay ( Ля Рош Позе) - цены на Ля Рош Позе - Интернет магазин; Лаборатория здоровья

Функции клеточной стенки: 1. Обусловливает форму клетки. 2. Защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление. 3. Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды питательные вещества. 4. Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ.

Метод выявления клеточной стенки — электронная микроскопия, плазмолиз.

Протопласты – клетки микроорганизмов, полностью утратившие клеточную стенку. Могут образовываться в результате мутаций, автолитических процессов, действия некоторых антибиотиков (лизоцима, пенициллина). Микоплазмы и L–формы бактерий представляют собой протопласты. Их получают и искусственно для исследовательских целей.

L-формы бактерий, их медицинское значение L-формы — это бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки (протопласт +/- остаток клеточной стенки), поэтому имеют своеобразную морфологию в виде крупных и мелких сферических клеток. Способны к размножению.

Цитоплазматическая мембрана располагается под клеточной стенкой (между ними — периплазматическое пространство). По строению является сложным липидобелковым комплексом, таким же, как у клеток эукариот (универсальная мембрана).

Функции цитоплазматической мембраны: 1. Является основным осмотическим и онкотическим барьером. 2. Участвует в энергетическом метаболизме и в активном транспорте питательных веществ в клетку, так как является местом локализации пермеаз и ферментов окислительного фосфорилирования. 3. Участвует в процессах дыхания и деления. 4. Участвует в синтезе компонентов клеточной клетки (пептидогликана). 5. Участвует в выделении из клетки токсинов и ферментов.

Цитоплазматическая мембрана выявляется только при электронной микроскопии.

Занятие 3. Сложные методы окрашивания. Окраска по Граму и Циль-Нильсену (кислотоустойчивых микроорганизмов).

Цель занятия.Овладеть методами окраски по Грамму и Циль-Нильсену.

Материалы и оборудование.Пробирки со взвесями бактерий (сальмонелл, стафилококков, эшерихий, вакцинного штамма сибирской язвы, атипичных микобактерий), спирт, раствор Люголя, генцианвиолет, фуксин Циля, 5% раствор серной кислоты, синька Леффлера, таблицы методов окраски.

СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ

Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является основной, главной краской, а другое дополнительной — контраст. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Обмывание мазка простой водой также является в какой-то степени чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполное. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых, Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото — и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивы. Наконец, некоторые, как, например, споры, энергично противостоящие воздействию всех обесцвечивающих веществ, относятся к группе краскоустойчивых.

Читайте также:  Цикломед глазные капли для расширения зрачков – инструкция по применению, цена, отзывы

Сложные методы окраски имеют важное дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба.

Окрашивание по Граму. Этот метод позволяет все микроорганизмы разделить на две группы: грамположительные (гр+) и грамотрицательные (гр–).

Техника окраски:

На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги пропитанной 1%-ым спиртовым раствором генцианвиолета. Наносят на бумажку 2-3 капли воды. Окрашивают 2-3 минуты.

Бумажку снимают и не промывая препарата водой, наносят раствор Люголя на 2 минуты.

Сливают раствор Люголя и препарат обрабатывают 96%-ным этиловым спиртом в течение 20-30 секунд.

Тщательно промывают мазок водой.

Окрашивают мазок фуксином Пфейффера в течение 2-3 минут.

Препарат промывают водой.

Высушивают и микроскопируют.

Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в розовый. Сущность окраски по Граму состоит в том, что отношение к краскам зависит от химического состава клетки и структурных особенностей клеточной стенки (наличие муреина и частично липида). В составе клеточной стенки грамположительных микроорганизмов большое количество муреина, воздействие этиловым спиртом вызывает разбухание муреина, что приводит к уменьшению диаметра пор и снижению проницаемости клеточной стенки. Поэтому не происходит вымывания красителя и обесцвечивания микробной клетки. В клеточной стенке грамотрицательных микроорганизмов муреиновый слой меньших размеров, диаметр пор больше и спирт легко проходит через клеточную стенку, вымывая краситель. Микробная клетка принимает цвет дополнительного красителя (красный). Кроме того, в поверхностном слое грамположительных микроорганизмов находиться магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которая в присутствии йода в кислой среде образует прочное соединение с основными красителями. Это так же препятствует обесцвечиванию их спиртом.

Пример: Escherichiacoli (кишечная палочка) иSalmonellacholeraesuis(возбудитель сальмонеллеза свиней) — грамотрицательные и окрашиваются в розово-красный цвет.Listeriamonocitogenes(возбудитель листериоза),Streptococcusecqui(возбудитель мыта) — грамположительные и окрашиваются генцианвиолетом в фиолетовый цвет.

Методы окраски бактерий микробиология

ОКРАСКА МИКРООРГАНИЗМОВ , метод бактериол. исследования, применяемый для обнаружения и изучения микробов при микроскопировании препаратов. Последние могут быть приготовлены из культур микробов или нативного материала — тканей органов, крови, мокроты, мочи, фекалий, гноя, молока и других (см. Бактериологическое исследование ).

О. м.— сложный физико-химич. процесс, при к-ром существенную роль играют рН среды, адсорбция, капиллярные явления, электрич. заряд и химич. состав красителя и окрашиваемых объектов. Эти факторы определяют взаимодействие отдельных структур микробной клетки с тем или иным красителем. На результаты О. м. оказывают влияние физиол. состояние микробов, способ приготовления препарата и метод окраски. Для О. м. применяют анилиновые красители, большая часть к-рых— соли кислот или оснований, поэтому эти красители, в свою очередь, подразделяются на основные и кислые. Для О. м. применяют гл. обр. основные красители, т. к. они быстрее фиксируются микробной клеткой. Кислые красители используют преим. для окрашивания фона препарата в контрастный цвет. Существуют также нейтральные красители (краска Романовского — Гимзы). В микробиол. практике наиболее употребительны анилиновые красители: красные — основной фуксин, сафранин, нейтральный красный, Конго красный; синие — метиленовый синий, толуидиновый синий, опаловый синий; фиолетовые — метил фиолетовый, кристаллич. фиолетовый, генциан фиолетовый, фиолетовый Гофмана; зелёный [зеленый] — малахитовый зелёный [зеленый] , бриллиантовый зелёный; [зеленый;] жёлто-коричневые [желто-коричневые] — везувин, хризоидин. Из красителей готовят водные или спиртово-водные р-ры. Для улучшения красящей способности нек-рых красителей к р-рам добавляют фенол, едкий калий, буру и др. Приготовление рабочих р-ров проводят по определённым [определенным] прописям.

Читайте также:  Воспалилось небо во рту около зубов чем лечить

Окраску производят как живых (витальная окраска), так и убитых микробов, фиксированных на предметном стекле. Для витальной О. м. готовят препараты раздавленной или висячей капли; краситель разводят в физиол. р-ре хлорида натрия (1:10000—1:100000). Живые микроорганизмы окрашиваются плохо, поэтому наиболее распространена окраска убитых микробов. О. м. проводят простым и сложным методами. При простом методе применяют к.-л. один краситель в рабочем р-ре, к-рым окрашивают препарат в течение 1—2 мин; затем краску смывают дистил. водой и высушивают препарат фильтровальной бумагой. Микробы окрашиваются в цвет используемого красителя. При сложном методе используют 2 красителя (основной и дополнительный) и различные реактивы. Этот метод позволяет отличить одну группу микробов от другой, выявить отдельные элементы микробной клетки (споры) или химич. вещества цитоплазмы (зёрна [зерна] волютина, нуклеотиды). К сложным методам О. м. относят: окраску по Грану, окраску кислотоустойчивых микробов (методы Циля — Нельсена и др.), спор микробов (методы Ожешко, Пешкова, Мюллера и др.), зёрен [зерен] волютина (методы Нейссера, Мейера), нуклеотидов (метод Фейльгена) и др. Во всех этих позитивных методах красители действуют непосредственно на микробную клетку. Существуют и негативные методы О. м., основанные на окрашивания фона препарата, на к-ром контрастно видны непрокрашенные микробы. Эти методы применяют в тех случаях, когда изучаемые микроорганизмы (напр., спирохеты) или отдельные элементы микробной клетки (напр., капсула) плохо окрашиваются. В нек-рых случаях используют комбинированные методы О. м., включающие позитивный и негативный способы окраски (метод Гинса для обнаружения капсул). Широкое распространение получили флюоресцентные красители, соединённые [соединенные] с сывороткой, содержащей антитела против микроба определённого [определенного] вида, благодаря чему при люминесцентной микроскопии происходит свечение этих микробных клеток. См. также Микроскопия .

Лит.: Розанов Н. И., Микробиологическая диагностика заболеваний с.-х. животных, М., 1952; Роуз Э., Химическая микробиология, [пер. с англ.], М., 1971.

Ссылка на основную публикацию
Строение языка человека (фото) о чем говорит цвет корня и спинки этого органа
Строение, цвет и фото здорового языка человека: как выглядит нормальный орган, каковы его функции? Язык представляет собой часть системы пищеварения...
Страх перед девушками как побороть, психология, примеры, методы
Почему возникает боязнь женщин и как от нее избавиться Гинофобия — тревожно-фобическое состояние, характеризующееся боязнью женщин. Также известно под названием...
Стреляет в ухе что делать, чем лечить
Что делать, если стреляет в ухе? Любой болезненный симптом, который чувствуется в ушах, не должен игнорироваться и быть без внимания....
Строение языка человека фото, в картинках и схема
Рак языка Представляет собой не самую частую форму среди онкологических заболеваний, но все же, он встречается достаточно регулярно, занимая большую...
Adblock detector